TMB都不知道，你怎么能懂肿瘤的免疫治疗？

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作者凤凰花开与癌共舞与癌共舞订阅号

在前几天的PD1扫盲贴中，反复的提到了一个词就是TMB，那么TMB是什么呢？
TMB，全称是“肿瘤基因突变负荷”，tumor mutational burden。肿瘤突变负荷（TMB）被定义为每百万碱基中被检测出的，体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。简单说就是看看病人肿瘤组织中到底有多少个基因突变。
肿瘤突变负荷相关的背景知识：
TMB涉及到两个重要概念germline mutation（种系突变或胚系突变）和somatic mutation（体细胞突变）。

胚系突变来自上一代，可以遗传，比如血友病等。Somatic突变为获得性突变，在诱变剂的影响下发生突变，可表现在RNA和蛋白水平，产生的新抗原（或新表位）、蛋白片段、肽段等被自身免疫系统识别为非自我（non-self）抗原，激活T细胞，引起免疫反应。下图简要阐述了从体细胞突变到激活免疫攻击的6个步骤。

体细胞突变可能受到外源性诱变因素的影响，比如肺癌中烟草（吸烟）诱导的C→A的突变。恶性黑色素瘤中，紫外线照射引起的C→T的突变。内源性因素引起的突变可以是DNA错配修复突变，比如结直肠癌和食管癌中的MSI（微卫星不稳定）。在实体肿瘤中，95%的突变为单个碱基的替换，造成的非同义突变（一个核苷酸突变改变一个蛋白的氨基酸顺序），错义突变（非同义点突变，单个核苷酸改变导致一个密码子编码一个不同的氨基酸）和无义突变（非同义点突变使一个密码子变为终止密码子引起多肽链合成提前终止），共同构成了体细胞非同义突变的基本要素。
TMB是如何真正起作用的呢？
TMB指的是一份肿瘤样本中，所评估基因的外显子编码区每兆碱基中发生置换和插入/缺失突变的总数。我们知道，体细胞的突变可转录/表达于在RNA/蛋白水平，产生新的抗原，蛋白片段或多肽段等，这些新的蛋白被自身免疫系统识别为非自身抗原，激活T细胞，引起免疫反应。因此，当每兆碱基中累积的基因变异数目增多时，就可以产生很多新的抗原。目前，在很多研究中都证实TMB和肿瘤新生抗原与免疫检查点抑制剂的疗效是相关的。
TMB检测与PD-1疗效

PD-1抗体药物是这两年，肿瘤免疫治疗领域的最大进展。但是针对大部分实体瘤，PD-1抗体的有效率大概只有20%。如何在患者用药之前就提前判断PD-1抗体是否有效呢？

我们都知道，基因可以调控蛋白质的表达。基因突变越多，产生的异常蛋白质就可能越多，因此就有更大的可能性激活免疫系统。基于这个概念，学术界认为直接测定肿瘤组织中的突变数量肿瘤突变负荷(TMB)，是可以预测PD-1抗体等免疫治疗的疗效的。

举个例子：
我们来看一下CheckMate-032临床试验
这是一项纳入401名一线治疗失败的晚期小细胞肺癌的I/II期临床试验，分成两组：一组接受PD-1抗体O药治疗，一组接受PD-1抗体O药和CTLA-4抗体I药治疗（具体方案是：O药1mg/kg+伊匹木单抗 3mg/kg）。
临床发现
科学家们对其中211位检测了TMB的患者，进行了深入的分析。发现突变负荷高的一组，疗效非常显著，尤其在联合治疗组，有效率不止翻倍，生存率直接是3倍。中位总生存时间，TMB低、中、高分别是3.4个月，3.6个月，22.0个月，相差6倍多！

纪念斯隆凯特琳癌症中心研究调查人员Matthew D. Hellmann说：“来自CheckMate-032的这些探索性TMB数据是首先显示使用突变负荷来预测两种免疫肿瘤学药物组合的患者反应的潜力。
TMB与驱动基因之间的关系
TMB是在预测肿瘤疗效及筛选获益人群方面的新尝试，与传统免疫治疗以及PD-L1的检测是互补的关系。TMB在恶性黑色素瘤、肺癌和大肠癌中的高表达与免疫治疗的临床疗效呈正相关。对于Opdivo来讲，PD-L1并不能作为预测其疗效的指标，然而，最新研究发现在TMB高的人群中应用Opdivo，疗效明显高于TMB低的人群，也说明PD-L1和TMB是可以互补的。

但是要把TMB与驱动基因的概念区分开来。针对突变型患者，驱动基因用来预测靶向药物疗效是有效的，我们之所以讨论TMB，其原因在于其对于野生型驱动基因的患者指导免疫治疗具有重要作用。目前NSCLC可以分为驱动基因阳性和野生型两类。对于驱动基因阳性的患者，如EGFR突变和ALK融合的NSCLC，这类患者的TMB通常较低，因为这类癌症中已经存在一个优势基因，所以整体的TMB较低。而TMB高的患者，驱动基因多为阴性。
免疫治疗相关生物标志物的新趋势
2017年，美国FDA批准pembrolizumab用于MSI-H/dMMR实体瘤患者。这是FDA首次批准不以肿瘤部位为参考，仅依靠生物标志物进行治疗选择的突破。这一消息是非常令人振奋的。希望这种先进理念能够在中国也得以实施。比如PD-1抑制剂等药物，可以通过快速获批，以及能够获批多个瘤种的适应症。
TMB的缺陷—正确认识TMB

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周彩存教授指出，TMB的检测远比想象的复杂，基因突变有点突变、插入缺失突变、拷贝数变异等，显然不同种类突变的预测意义是不一样的，插入/缺失突变产生新生抗原的机会可能更大，不同种类突变的权重需要专业的检测公司来评价。例如肾癌的抗PD-1/PD-L1疗效，无法简单通过TMB预测，原因可能是插入/缺失突变导致的neoantigen更多，而实际其TMB的权重可能没有那么高。全外显子检测TMB存在检测周期长，经济成本高等缺点，checkmate026研究用的foundation medicine的大panel（315个基因），结果显示该panel的检测结果与WES的检测结果相关性非常好；MSKCC的大panel（341基因）、裕策生物的大panel（811基因）检测结果与WES相关性也很强。Panel做的足够大设计的又合理，可以取代WES，NGS大panel作为伴随诊断是大趋势。单纯地TMB并不能解决所有的问题，例如对于炎性肿瘤和非炎性肿瘤都有TMB的高表达，但是非炎性肿瘤的免疫治疗效果并不好，况且TMB的cutoff值与PD-L1表达一样，并没有统一标准。宋勇教授指出PD-L1表达与TMB弱相关，即高TMB与高PD-L1表达不是同一人群，我们需要更多Biomarker。
如何检测TMB？在临床工作中TMB检测有哪些挑战？
目前检测TMB最常用的方法为二代测序（Next Generation Sequencing,NGS）。但该方法存在一定挑战，如随着检测平台不同，所检测的基因panel不同，会导致Cut-off值出现差异，且数据复杂，需要专业的生物信息学团队进行解读，价格昂贵，医保难以覆盖。
尽管存在一定的困难，但TMB作为一个新型的Biomarker用来筛选抗PD-1/PD-L1免疫治疗获益人群，可与PD-L1的检测形成互补。相信，在不久的将来，随着上述挑战的解决，会使目前火热的免疫疗法如虎添翼。